En 1537, uno de los lugartenientes de Mendoza, Juan de Salazar de Espinosa, fundó Asunción (hoy capital de Paraguay), que fue el primer asentamiento permanente en la cuenca del Río de la Plata. Desde su base en Asunción, los españoles fueron gradualmente controlando todo el territorio situado entre los ríos Paraná y Paraguay. Entretanto, las favorables condiciones naturales hicieron que los pequeños rebaños de ganado traídos desde España se multiplicaran y extendieran por la Pampa, creando una situación apta para una economía agrícola estable.

Santiago del Estero, el primer asentamiento permanente de lo que hoy es territorio argentino, fue fundado en 1553 por colonizadores españoles provenientes de Perú. En 1573 fueron fundadas Córdoba y Santa Fe, y en 1580 se inició la repoblación de Buenos Aires. En 1620, toda la región del Río de la Plata quedó bajo el control administrativo del virreinato del Perú. Debido a la restrictiva política comercial del gobierno español, la colonización de la región fue lenta durante el siglo siguiente. Buenos Aires, centro de un floreciente tráfico de productos importados, creció constantemente y a mediados del siglo XVIII su población se acercaba a los 20.000 habitantes. En 1776, el territorio ocupado por las actuales Argentina, Bolivia, Paraguay y Uruguay fue separado de Perú, creándose el Virreinato del Río de la Plata.